磷酸盐缓冲液配方表 ph9(磷酸盐缓冲液配方表磷酸二氢钾)

在本篇,我们将针对缓冲液对AAV稳定性的影响及其改进策略展开详细讨论。目前针对AAV储存液配方系统性深入研究的文章或报告鲜有报道。但我们可以参考更为成熟的重组蛋白药物,合适的储存液配方和制剂辅料可显著提高重组蛋白药物的稳定性,已是不争的事实。同样的策略也适用于AAV制剂,通过添加适合的制剂辅料可以有效增加生物制品的溶解性,提高其物理化学上的稳定性。能够增加生物制品稳定性的辅料种类也有很多,例如糖、盐、聚合物、表面活性剂和氨基酸等,它们可通过与蛋白质、器皿表面或水之间的相互作用来增加蛋白质的稳定性。

(1)渗透剂:渗透液是一种小分子有机化合物,可广泛应用于增加蛋白质稳定性,防止蛋白质变性和聚集。水溶液中的蛋白质处于一种折叠(F,folded)和展开(U,unfolded)之间的平衡状态。稳定作用通过一种优先排斥机制发生,将蛋白质溶液平衡向F状态方向移动。在生物制药配方中使用最广泛的渗透剂有蔗糖、甘氨酸、甘露醇、组氨酸、葡萄糖、精氨酸、海藻糖和乳糖。此外,蔗糖还可显著提高载体产量,例如,在细胞培养基中加入0.2M蔗糖,使AAV2和rAAV2-retro的产量分别提高了1.9倍和1.5倍(见下图),这可能是由于蔗糖在下游苛刻的纯化过程中提高了AAV稳定性所致【1】。有趣的是,蔗糖处理对AAV5产量却没有显著影响。同时蔗糖还具有成本低、易获取、安全性高等优点,可以被广泛用于各种生产制剂过程中。

磷酸盐缓冲液配方表 ph9(磷酸盐缓冲液配方表磷酸二氢钾)

(2)缓冲液和pH:缓冲液和pH对于病毒衣壳蛋白的构象和胶体稳定性具有非常重要的影响,蛋白质仅在一个非常窄的pH范围内可以保持稳定。pH决定了蛋白质分子上的净电荷及溶液中蛋白质间的静电相互作用。一般来说,净电荷越高,由于静电排斥而引起的蛋白聚集倾向就会越低,胶体的稳定性则会越高。

缓冲液和pH还可以影响载体的稳定性和活性。Venkatakrishnan B 等人报道了pH对AAV衣壳的结构的影响,当pH从7.5降低到4.0时,AAV1和AAV6中衣壳蛋白VP1结构域的a-螺旋结构逐渐消失;当pH增加到7.5时,这种结构变化被逆转【2】。AAV载体在低pH值条件下稳定性较差,因此磷酸盐缓冲液并不适合在冷冻条件下储存病毒载体,由于其成分的溶解性较差,在冷冻期期间会产生选择性沉淀,导致 pH 值降低,可能会进一步引起AAV衣壳变性。

磷酸盐缓冲液配方表 ph9(磷酸盐缓冲液配方表磷酸二氢钾)

上图a,显示了不同缓冲液成分对AAV热稳定性的影响,表明不同的缓冲液对不同血清型AAV的热稳定性有不同的影响。上图b显示了在柠檬酸缓冲液中pH(pH=3~7)对AAV1、AAV2、AAV5、AAV6.2、AAV8和AAV9载体的热稳定性的影响,结果表明AAV的热稳定性受到pH值变化的强烈影响,并且针对不同血清型AAV的影响是不同的,AAV1、AAV6.2和AAV9的热稳定性在pH5和pH7之间相对较高,而在pH3和pH5之间显著降低。AAV2和AAV8的热稳定性在pH5时达到最大,而AAV5的热稳定性在pH3到pH7逐渐升高【3】。

(3)盐:盐类对衣壳蛋白稳定性的影响是复杂的,这取决于盐的类型、盐浓度、离子间相互作用以及蛋白质中带电残基之间的静电相互作用等因素。在蛋白质水溶液中,加入少量的中性盐[即稀浓度],如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等,会增加蛋白质分子表面的电荷,增强蛋白质分子与水分子的作用,从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合,可以保护蛋白质,具有让蛋白质不易变性,稳定性更高的优点。将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)具有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,破坏蛋白质的胶体性质,蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。此外,盐效应强烈地依赖于溶液pH,因为pH决定了蛋白质基团中可电离氨基酸的带电状态,大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度度最低【4】。

磷酸盐缓冲液配方表 ph9(磷酸盐缓冲液配方表磷酸二氢钾)

上图显示了AAV2溶解聚集状态受到盐浓度和盐种类影响的情况。与一定浓度的氯化钠溶液相比,相对较低浓度的多价离子盐足以防止AAV的聚集。例如,可以阻止AAV聚集,而~350mOsm的氯化钠可以防止AAV聚集,而~200mOsm的硫酸镁就能达到类似的效果。

(4)表面活性剂:蛋白质可以在剪应力或暴露于空气-水界面时变性、聚集甚至沉淀,导致形成可溶性和不溶性聚集物。AAV在制备纯化过程中的溶液扰动增加了空气/水界面的接触面积,由于空气/水界面是疏水的,蛋白质在界面上重新定位并暴露疏水区域,以最大限度地发挥它们与界面的相互作用。蛋白质的疏水区域增加了分子间蛋白质?蛋白相互作用的机会,从而增加了蛋白质聚集的概率。衣壳蛋白的聚集一方面降低了AAV回收率,一方面可提高了AAV免疫原性,降低其药效。目前蛋白制剂开发生产中及上市产品中,为了提高蛋白质的稳定性,非离子表面活性剂是一种必要的添加辅料。在低浓度非离子表面活性剂情况下,表面活性剂优先占据溶液中的疏水界面,竞争性的抑制溶液中蛋白质分子与疏水界面的接触(竞争界面吸附),从而对蛋白质起到保护作用,随着非离子表面活性剂浓度的升高,表面活性剂与蛋白质分子表面少量疏水位点结合,可抑制蛋白质分子与蛋白质分子间的相互作用,从而抑制蛋白质聚集。目前蛋白质制剂中使用较为广泛的非离子表面活性剂,例如吐温80、吐温20、泊洛沙姆188(poloxamer 188)、PF-68(Pluronic F68)等。目前已上市的两款AAV制品,Luxturna和Zolgensma采用的表面活性剂为泊洛沙姆188。此外,众多研究结果表明通过在AAV制剂中添加PF-68(Pluronic F68)可有效降低了AAV的吸附,增加了AAV的回收率,下图显示了Bennicelli 等人的研究结果【5、6】。

磷酸盐缓冲液配方表 ph9(磷酸盐缓冲液配方表磷酸二氢钾)

磷酸盐缓冲液配方表 ph9(磷酸盐缓冲液配方表磷酸二氢钾)

(5)自由基清除剂:蛋白质中氨基酸氧化是蛋白化学不稳定的主要因素之一,其中蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸、酪氨酸和色氨酸等易被氧化。Reinauer EB 等人研究表明腺病毒载体Ad5对自身蛋氨酸氧化敏感,通过病毒载体制剂中添加游离蛋氨酸,能够有效抑制腺病毒载体的失活【7】。此外,由于生产原料及辅料中的金属离子杂质的影响,衣壳蛋白易遭到氧化。Evans RK等人研究表明在以蔗糖为低温保护剂,吐温80为非离子表面活性剂的病毒载体制剂配方(A105)中,金属离子引发的氧化是Ad5失活的重要机制,使用游离氨基酸(如蛋氨酸、组氨酸等)和金属离子清除剂(如乙醇、EDTA和DTPA等)可以防止病毒载体的氧化【8】。

(6)通过化学修饰来稳定病毒载体:随着合成技术的快速发展,通过化学修饰生物大分子来改变生物大分子特性,增强其稳定性等策略得到了广泛应用,如 PEG(聚乙二醇)修饰蛋白已经成功实现商品化。PEG常被用于改善蛋白质药物的药代动力学和药效学,是一种常用于修饰病毒的高分子材料,并已被研究用于病毒载体的保护,PEG的末端羟基能够被亲电基团取代得到活化的PEG,该衍生物能够进一步与病毒衣壳氨基酸反应从而对病毒进行修饰,在AAV生产制备过程中可增加AAV稳定性。Yao T等人的研究表明PEG修饰后的AAV在人类血清中稳定性提高了1.7-2.4倍,被抗体识别率明显降低【9】。此外,Mathieu Mével等人通过突变VP3序列和引入非自然氨基酸,可以改变AAV衣壳的某些特异性。AAV2衣壳中的丝氨酸、苏氨酸和赖氨酸残基突变为丙氨酸或精氨酸可以提高AAV在细胞内稳定性,进而提高其转导效率【10】。Zhang C 等人将一种功能化的RGD肽移植到转基因AAV的衣壳上,可使其特异性靶向肿瘤细胞【11】。

(7)避免由于微生物污染导致的不稳定:针对AAV制品的稳定性研究,除了上述的物理不稳定性和化学不稳定性外,生物学与微生物学稳定性也是需要考虑的因素之一,药物制剂受微生物污染易使产品变质、腐败,尤其是液体制剂产品。而AAV制品大多数情况下都是液体制剂,极易受到微量微生物污染的威胁。因此,在AAV的灌装过程中需要符合法律法规对于无菌灌装的要求,以保证最终产品的无菌性、无热原、无可见异物、无可溶性微粒等。众所周知,人工干预是影响无菌灌装工艺的最大干扰因素,近期Cytiva推出的无菌灌装工作单元Vanrx,作为一台集成化无操作手套的机器人隔离器系统,可以完全避免无菌灌装过程中的人为因素。先进的自动化系统将无菌灌装各方面需求都完美结合在一起,加上标准化的操作,不仅可以大大减少了无菌灌装过程中的风险,而且仅需45分钟即可灵活地进行项目转换。完善的物流供应保证了快速的交付周期,进一步助力基因治疗药物的上市。

创业项目群,学习操作 18个小项目,添加 微信:80709525  备注:小项目

本文内容由互联网用户自发贡献,该文观点仅代表作者本人。本站仅提供信息存储空间服务,不拥有所有权,不承担相关法律责任。如发现本站有涉嫌抄袭侵权/违法违规的内容, 请发送邮件至 sumchina520@foxmail.com 举报,一经查实,本站将立刻删除。
如若转载,请注明出处:https://www.ixoh.com/3097.html